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2015-07-04| 发布者: admin| 查看: |

实验目的
1. 学习微生物的染色技术
2. 熟悉普通染色法、革兰氏染色法和芽孢染色法
实验原理
微生物的染色是微生物学实验中的一项基本技术。微生物的细胞小而透明,在普通光学显微镜下不易识别,必须对它们进行染色。染色后微生物细胞与背景形成明显的色差,从而能清楚地观察到其形态。
用于微生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷,可与带负电荷的物质结合。而微生物蛋白质常带负电荷.所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷,能与带正电荷的物质结合。中性染料是前两者的结合物又称复合染料。普通染色法是利用一种染料使微生物着色。它操作简单,但仅能显示其基本形态。
革兰氏染色法是细菌学中的鉴别性染色法。通过革兰氏染色可将细菌区分为革兰氏阳性菌(反应呈初染剂的颜色)和革兰氏阴性菌(反应呈复染剂的颜色)两大类。此染色法能将细菌分为G +菌和G -菌,是因为这两类菌的细胞壁结构和成分的不同。G +菌细胞壁中肽聚糖层厚、交联度高,且脂类含量低,经乙醇脱色后反而使肽聚糖层的孔径缩小,细胞壁通透性降低,因而仍保留初染剂的颜色。G -菌的细胞壁中肽聚糖层较薄、交联度低,脂含量高,用乙醇脱色时脂类物质被溶解,增加了细胞壁的通透性,使结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌被脱色,复染后染上了复染剂的颜色。
芽胞染色法利用芽胞和营养体对染料的亲和力不同而使芽胞和营养体染上不同的颜色,从而更明显地衬托出芽胞,便于观察。细菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是利用芽胞既难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点,除了用着色力强的染料外,还需要加热,以促进芽胞着色,再使菌体脱色,而芽胞上的染料则难以渗出,仍保留原有的颜色,然后用对比度强的染料对菌体复染,使菌体和芽胞呈现出不同的颜色。
第二部分 实验材料
1.菌种:大肠杆菌和四联球菌混合液,杀螟杆菌
2.染色液:石炭酸复红液,结晶紫液,路哥尔碘液,芽胞染色液
3.仪器及器皿:显微镜,载玻片,接种环,二甲苯,香柏油,擦镜纸,吸水纸,煤气灯或酒精灯。
第三部分 实验步骤
(一)普通染色法
1. 涂片 将接种环在火焰上烧红,稍冷后以无菌操作自试管中取少量菌液于洁净无油腻的玻片中央,涂成薄层。如为固体培养基上的菌种,则先在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水,用无菌操作法挑取少许菌体与水滴充分混匀,涂成薄层。
2. 干燥 室温中自然干燥,也可在火焰高处烘干,但不能过烫,以手背试温不烫手为宜。
3. 固定 手执玻片一端,有菌膜的一面朝上,于火焰中通过3 次(用手指触涂片反面,以不烫手为宜),不能在火中烤,以免菌体形态受到破坏。待玻片冷却后,再加染料。
4.`染色 将玻片放平,在其上加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红染色液),染色约一分钟。
5. 水洗 染色时间到后,用水冲去染料直至流下的水无色为止。冲洗时注意水流不能太急,且不能冲洗有菌的一面,以防将菌体细胞冲跑。
6. 干燥 自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。
7. 镜检 用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。
注意:
1.玻片要洁净无油,否则菌液涂不开。
2.挑菌量宜少,涂片宜薄,过厚不易观察。
(二)革兰氏染色法
1.涂片,干燥,固定见普通染色法。
2.染色 
初染 加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度),染色约一分钟后用自来水小心地冲洗。
媒染 加路哥尔碘液,约一分钟后水洗。
脱色 用95%乙醇脱色20 秒水洗。
复染 滴加石炭酸复红染色液染色约30 秒,水洗。
3. 干燥自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。
4.镜检用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。并判断菌体的革兰氏染色反应性。
注意:
1.革兰氏染色的关键是脱色时间。脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色误认为是革兰氏阴性菌,脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。
2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水以免染色液被稀释而影响染色效果。
(三)芽胞染色法
1.涂片,干燥,固定见普通染色法。
2. 染色 加5%孔雀绿水溶液于玻片上,用微火加热至染色液冒蒸汽,维持约5 分钟,(期间需添加染色液,添加前须冷却,加热火焰要小),冷却后水洗。用石炭酸复红染色液染30 秒后水洗。
3.干燥 自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。
4.镜检 用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。注意芽胞和营养体各自的颜色。
 
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